衰竭心肌中神经酰胺从头合成及累积的增加

背景

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脂质代谢异常可能导致心肌损伤和重构。为了确定心衰患者体内是否存在长链神经酰胺的累积，作者对接受左心室辅助装置治疗的严重心力衰竭（HF）患者和对照组人群的心肌组织和血清中神经酰胺进行了分析。脂质组学分析显示晚期心衰患者心肌和血清中的总神经酰胺和超长链神经酰胺均存在增加。辅助装置卸载后，这些变化表现出部分可逆性。心肌梗死（MI）后，神经酰胺从头合成途径的限速酶丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）及神经酰胺有所增加。利用特异性抑制剂肉豆蔻素对SPT进行阻断后，缺血性心肌梗死疾病中神经酰胺积聚减少，C16、C24:1和C24神经酰胺也有下降趋势。而且，SPT抑制也降低了心肌梗死后心室重构、纤维化和巨噬细胞的含量。此外，SPTLC2基因的缺失可以保护MI后的心脏功能。最后，体外研究显示神经酰胺合成的变化与缺氧及炎症有关。总之，神经酰胺在衰竭心肌中积聚，并且在血液循环中也可以检测到有所增加。抑制神经酰胺的从头合成可降低心脏重构。由此可认为神经酰胺的从头合成对病理性心脏重塑和功能障碍具促进作用。

实验结果

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1.心力衰竭患者心脏和循环系统中神经酰胺水平升高

作者对中度和晚期心衰患者的样本进行了脂质组学分析，以研究血清和心肌中的特异性神经酰胺和总神经酰胺含量的变化。结果显示心衰组和对照组的循环系统中神经酰胺总含量水平无显著差异，几种长链和超长链神经酰胺，包括C16、C18、C20:1、C20、C22:1和C24:1，在心衰患者血清中的水平升高，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白胆固醇水平随着心衰的进展而降低，而甘油三酯水平无差异。图1D显示了按心衰严重程度分组的患者和对照组人群的神经酰胺含量。对晚期心衰患者放置心室辅助装置（VAD）时的心肌组织样本与从正常心脏获得的样本进行比较，结果显示心脏中神经酰胺的总水平增加，包括一些长链和超长链神经酰胺，例如C16:1、C16和C24:1神经酰胺。

长链神经酰胺的增加可能是多种神经酰胺合成途径的产物。衰竭心肌样本的丝氨酸棕榈酰转移酶长链2（SPTLC2）水平升高，而SPTLC1和SPTLC3水平无明显变化，提示心肌神经酰胺合成的从头途径被激活。此外，作者并没有发现神经酰胺合成酶水平升高，事实上，在衰竭心肌中神经酰胺合成酶2（CERS2）的蛋白水平降低。心脏神经酰胺合成的其他限速酶（包括ASM、CERS1和CERS5）也没有变化。

Figure1(A)重度心衰患者和对照组循环系统神经酰胺水平(B)心衰患者和对照组循环系统神经酰胺种类的脂质组学分析(C)总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平(D)对照组和心衰患者血清中神经酰胺热图分析(E)重度心衰患者和对照组的心肌神经酰胺水平(F)心衰患者和对照组心肌神经酰胺水平。(G)心肌神经酰胺种类热图分析(H)细胞内神经酰胺合成关键蛋白的相对变化(I)神经酰胺合成途径关键蛋白的WB结果

2.机械卸载降低人心衰心肌神经酰胺含量

作者采用液相色谱-质谱（LS/MS）脂质组学方法分析了VAD放置前后心肌标本。晚期心衰患者通过VAD进行的心肌机械卸载导致循环中神经酰胺总水平的轻微增加，包括C14和C24神经酰胺的增加。相反，在VAD机械卸载后，衰竭心肌中的总神经酰胺和某些神经酰胺含量降低，包括C16:1、C16、C20:1、C20、C22:1和C24:1。有趣的是，神经酰胺水平的降低并不伴随着SPTLC2的降低，反而是SPTLC3的蛋白水平随着机械卸载而降低。此外，CERS2的蛋白水平降低，而CERS1、CERS5和ASM的水平在VAD前后的样本中没有显示差异。这些数据表明，心肌卸载和相关的逆向重构和代谢的变化伴随着某些心脏神经酰胺合成途径的降低。

Figure2(A)晚期心衰患者VAD植入前和植入后循环系统神经酰胺水平(B)晚期心衰患者VAD植入前后循环系统神经酰胺种类的相对差异(C)血清神经酰胺热图(D)VAD植入前后心肌神经酰胺水平(E)VAD植入前后心肌神经酰胺水平变化(F)心肌神经酰胺种类热图分析(G)神经酰胺合成关键蛋白的相对差异(H)神经酰胺合成途径关键蛋白的WB结果

3.心肌梗死动物模型心肌神经酰胺水平升高

接下来作者研究了缺血诱导的小鼠心衰模型是否也存在神经酰胺代谢的改变。心肌缺血2周后，造模组小鼠与空白组小鼠相比，造模组小鼠空腹血糖水平降低，循环系统中游离脂肪酸（FFA）和总胆固醇（TC）水平升高，TG则无显著变化。心肌梗死后2周后，循环系统中神经酰胺总体水平上升，其中包括C16、C18、C24:1、C24和C26:1神经酰胺，同时心肌中神经酰胺总量在心肌梗死后2周也有所升高，包括C14、C18、C20:1、C20和C22:1神经酰胺的增加。心肌梗死10周后，造模组动物的血糖和胆固醇水平恢复到对照水平，而TG和FFA水平升高，循环系统中神经酰胺总量或单独的神经酰胺均无差异，心肌组织中神经酰胺总量有所上升，C16、C24:1和C24神经酰胺（在衰竭心肌中显著增加。接下来，作者分析了心脏神经酰胺代谢关键酶的基因表达和蛋白水平，结果显示心肌细胞神经酰胺合成关键酶基因表达并无差异。与之前人体样本结果一致的是，心肌梗死小鼠的心脏SPTLC2蛋白水平升高，而CERS2和ASM的蛋白水平没有改变。

Figure3(A)心肌梗死2后周血清总神经酰胺和各种神经酰胺水平升高（B)心肌梗死2周后心肌总神经酰胺和各种神经酰胺水平升高(C)心肌梗死10周后动物循环系统神经酰胺含量(D)心肌梗死10周后动物心脏神经酰胺含量(E)细胞神经酰胺合成关键酶的WB结果(F)神经酰胺合成关键酶的定量分析

4.SPT调节细胞神经酰胺水平、细胞凋亡和氧化磷酸化（OXPHOS）

为了检测SPTLC2的单独增加是否影响神经酰胺的产生，作者检测了SPTLC1和SPTLC2过度表达对人心肌细胞系（AC16）神经酰胺水平和组成的影响。结果显示只有SPTLC1过表达增加了细胞内神经酰胺总含量，包括长链神经酰胺C22:1、C24、C24:1和C26:1的含量。SPTLC1和SPTLC2的过度表达也与细胞凋亡增加有关。此外，细胞氧化代谢分析显示SPTLC1和SPTLC2过表达抑制细胞氧化。最后，为了研究SPT的特异性抑制是否改变细胞神经酰胺水平，包括特异性的长链神经酰胺，作者用特异性SPT抑制剂肉豆蔻素孵育AC16细胞。结果显示用肉豆蔻素孵育AC16细胞后，细胞内神经酰胺总量及C14、C18、C20:1、C22、C24:1、C24、C26:1和C26神经酰胺合成减少。

Figure4(A)AC16细胞中SPTLC1和SPTLC2过度表达引起的总神经酰胺和单个神经酰胺水平的增加（B)SPTLC1和SPTLC2过度表达导致细胞凋亡增加。(C)细胞氧化代谢分析(D)SPTLC1和SPTLC2过度表达导致的基础呼吸、ATP运转、H+漏出和呼吸能力的平均数据(E)肉豆蔻素对AC16细胞神经酰胺水平的影响

5.肉豆蔻素抑制SPT对心脏重构的影响

接下来作者研究了肉豆蔻素诱导的SPT抑制是否改变了心脏神经酰胺代谢和重构。与空白饮食组相比，肉豆蔻素治疗组动物的LV扩张被阻止。此外，肉豆蔻素治疗的动物显示出更好的心肌收缩功能。

Figure5(A)不同组间左室舒张末期内径（LVEDD）水平（B)不同组间LVEDD动态变化(C)不同组间心室缩短分数（FS）水平(D)不同组间FS动态变化

6.通过肉豆蔻素治疗抑制SPT可减少心脏炎症和纤维化

肉豆蔻素治疗后，心肌胶原含量及巨噬细胞含量均有所下降，此外，肉豆蔻素对细胞凋亡也有一定的下调趋势。

Figure5(E)心肌胶原蛋白含量（F)巨噬细胞含量(G)细胞凋亡水平

7.肉豆蔻素抑制SPT对心肌神经酰胺合成及组成的影响

用肉豆蔻素治疗可减少衰竭心肌中某些种类神经酰胺（C16、C18:1、C22、C24:1、C24，C26:1和C26神经酰胺）含量，但不影响循环系统内神经酰胺水平。在肉豆蔻素治疗组中，只有C18神经酰胺（CerS1的选择性产物）显著增加，这与CerS1的蛋白质水平增加相一致。肉豆蔻素治疗心肌梗死后，没有改变心脏甘油三酯水平，也没有改变血清中游离脂肪酸和总胆固醇水平。

Figure5(H)肉豆蔻素治疗后心肌神经酰胺水平

8.Sptlc2基因缺失对心肌梗死后小鼠心脏功能具保护作用

Sptlc2敲除小鼠心肌中总神经酰胺和单个神经酰胺的脂质组学分析显示，与野生型小鼠相比，神经酰胺含量显著降低。在心肌梗死2个月后，与对照组相比，Sptlc2–/–小鼠的左室收缩功能受损较少，LVEDD有减少扩张的趋势。

Figure5(I)Spltlc2敲除小鼠与野生型小鼠神经酰胺的脂质组学分析（J)Spltlc2敲除小鼠与对照组小鼠缩短分数（FS）(K)Spltlc2敲除小鼠与对照组小鼠左室舒张末期内径（LVEDD）

总结

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在衰竭心肌的慢性重塑过程中，存在着神经酰胺总量和长链神经酰胺的积累，抑制神经酰胺的从头合成可以纠正神经酰胺含量和组成的异常。这些发现为慢性左心室功能不全相关的全身和心肌脂质代谢提供了新的理解。但是，药物干预神经酰胺合成的途径对心衰是否有益，还需要进一步的实验证明。

撰文：于滕杰

排版：毛姝英

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