新型靶向药物拉帕替尼对人卵巢癌细胞SKO

王玥

中南大学药学院

　　目的：分析新型靶向药物拉帕替尼对人卵巢癌细胞SKOV3的影响，评价拉帕替尼在卵巢癌治疗中的价值。

　　方法：采用体外实验研究，培养人卵巢癌细胞株SKOV3，进行分组，包括低中高实验组、对照组、模型组，采用流式细胞仪分析细胞周期，采用MTT方法检测细胞活力。

　　结果：实验组人卵巢癌细胞SKOVS细胞活力、细胞周期与对照组、模型组组间比较存在显著差异（P＜0.05），低、中、高剂量实验组指标呈现阶梯变化。

　　结论：拉帕替尼对人卵巢癌细胞SKOV3细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈现剂量依赖。

　　卵巢是肿瘤好发部位，卵巢癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，我国发病率约为7‰～10‰，多见于围绝经期女性，近年来卵巢癌发病率呈上升趋势。卵巢癌危害较大，我国卵巢癌死亡率约为1.45/10万，是死亡率最高的恶性肿瘤，高于宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌。卵巢癌发病、进展机制较复杂，治疗难度大，近年来有关于卵巢癌的发病生物学、分子学机制研究越来越深入，以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点的药物，并开始用于临床。拉帕替尼是一种经典的以EGFR为靶点的抑制剂，其应用时间相对较晚，本次研究试以人卵巢癌细胞SKOV3作为研究对象，分析其对细胞生长的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　仪器与试剂

　　人卵巢液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3，医学实验中心提供，10%胎牛血清培养。拉帕替尼，大连美仑生物技术公司提供。胰蛋白酶、二甲基亚砜、胎牛血清等。倒置相差显微镜，荧光显微镜，超净工作台，Epics流式细胞仪，低温冰箱等。

　　1.2　方法

　　1.2.1　细胞培养

　　取液氮冻存细胞，37℃温水中解冻，超净工作台上操作，将细胞移入离心管，加入10倍RPMI-培养液，离心，rpm/min，离心5～10min，弃上清，细胞沉淀加PRMI-培养液，摇匀，37℃、5%CO2培养箱中培养。待目标细胞生长到80%～90%培养瓶，弃培养液，采用PBS缓冲液漂洗两遍，倒置显微镜鉴定合格，加入培养液胰酶消化液，将已经消化过的细胞脱离培养瓶，rpm/min，5min，弃上清，显微镜下细胞计数，进行1：3比例传代培养，分装至培养瓶。取对数生长周期细胞0.25%胰蛋白酶消化离心，PSB漂洗2次，rpm离心，5min，弃上清，加入-20℃DMSO细胞冻存液，移入冻存管，4℃静置30min，-20℃保存2h，转入-80℃超低温冰箱，长期保存着24h后转移到-80℃液氮中。

　　1.2.2　分组

　　低中高实验组、对照组、模型组。将培养得到的细胞株，rpm离心5min，PBS漂洗1次，弃上清，调整密度为8×/ml。取接3个96孔板，每个时间点1板，μl/孔，每个孔，做好分组标记。低中高实验组加入浓度分别为20、30、60μmol/L拉帕替尼，对照组只含有等量的溶剂，模型组不做任何处理。37℃，5%CO2，条件下培养24h，时间到后，去上清液，每孔加入5g/L的MTT共10μl，常规处理，在微板测试系统上，在nm波长处测定各孔光密度OD值，计算细胞抑制率。培养48h后，采用PI染色法流式细胞技术测定细胞周期。

　　1.3　统计学处理

　　以WPS数据表XLS录入数据，采用SPSS18.0软件进行数学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）描述统计，采用柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫（Kolmogorov-Sminmov）检验法进行正态性检验，服从正态分布组间比较采用t检验或方差分析，若不服从正态分布采用非参数统计Mann-WhitneyU秩和检验，计数资料以数（n）或率（%）描述统计，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

　　2　结果

　　实验组各剂量亚组、对照组、模型组OD与抑制率组间比较存在显著差异（P＜0.05），低、中、高剂量实验组指标呈现阶梯变化。实验组各剂量亚组、对照组、模型组G0/G1、S、G2/M水平组间比较存在显著差异（P＜0.05），低、中、高剂量S、G2/M实验组指标呈现阶梯变化。

　　3　讨论

　　本次研究证实，拉帕替尼对人卵巢癌细胞SKOV3的细胞周期、活性具有显著影响。实验组各剂量亚组、对照组、模型组OD与抑制率组间比较存在显著差异（P＜0.05），低、中、高剂量实验组指标呈现阶梯变化，提示各拉帕替尼在体外可明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3的活性，且呈现明显的剂量依赖。同理，拉帕替尼在体外可明显抑制人卵巢癌细胞细胞生长，降低S期比重，将细胞阻滞在G0/G1周期，众所周知，卵巢癌细胞周期直接影响患者的预后。目前关于拉帕替尼的体外癌细胞作用研究并不少见，但主要集中在乳腺癌上，理论上其不仅仅可对卵巢癌细胞产生显著的抑制作用，在肝癌等其他恶性肿瘤细胞中也会发挥重要。

　　拉帕替尼的研发企业经大量的研究证实，该药可逆性结合EGFR、HER2受体，这些受体位于细胞区域ATP结合位点，这一结构与丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶等信号通路关系密切，最终影响细胞的分裂、增殖、分化、迁移。众所周知，恶性肿瘤最大的特征在于恶性的分裂、增殖、分化、迁移，这也是恶性肿瘤难治的根本原因，拉帕替尼通过这一靶点，通过影响MAPK、PICK等信号通路，从而抑制肿瘤活动。近年来个体化治疗越来越受到重视，极大的提高了恶性肿瘤的治疗水平，鉴于拉帕替尼的作用机制，其对HER2过度表达的转移晚期乳腺癌疗效肯定，目前关于拉帕替尼治疗卵巢癌的临床研究并不多见，卵巢癌拉帕替尼靶点HER2过度表达率约为25%～32%，处于较高水平，理论上采用拉帕替尼具有一定的疗效。Kimball等对卵巢癌的Ⅰ期间临床研究证实，拉帕替尼联合卡铂治疗复发性卵巢癌的敏感性疗效较好。目前，拉帕替尼主要通过与卡培他滨联合治好了，曾经接受蒽环类、紫杉类药物化疗，以及曲妥珠单抗治疗失败，HER2过度表达晚期以及转移性乳腺癌治疗，其对卵巢癌疗效研究有待深入。卵巢癌死亡率相对更高，患者晚期生存时间短，一定程度上限制了拉帕替尼的应用。此外，不同于乳腺癌，HER2在卵巢癌中的表达虽然较高，但是在良性卵巢中的表达也较高，其在卵巢癌发生、进展、转移中的作用可能并不突出，目前关于卵巢癌靶点研究集中在热休克蛋白、锰超氧化物歧化酶等因子上。

　　需注意的是，人体正常细胞也有大量的HER2表达，拉帕替尼与其他生长因子受体靶点药物一样，也存在不良反应，已知的不良反应主要包括腹泻、恶心、呕吐、手足综合征、左室射血分数下降、间质性肺炎等。近年来，拉帕替尼在乳腺癌广泛应用也出现了耐药问题，为防范于未然，也有必要深入研究其在卵巢癌中的作用机制，提高合理应用水平，避免过早出现耐药。

　　综上所述：拉帕替尼对人卵巢癌细胞SKOV3细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈现剂量依赖，但缺乏临床研究证实，其体内作用机制有待深入研究。

参考文献

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