MAPK1功能上调导致RAS病谱系中的神

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简介RAF-MEK-ERK通路作为最早被描述的MAPK级联反应介导了多种对生长因子，细胞因子和激素反应的细胞进程。MAPK通路参与了各种早期和晚期的发育进程，包括器官发生，形态固定，突触可塑性和生长。RAS-MAPK通路级联反应上的基因发生生殖系突变会导致RAS病，这类基因缺陷有独特的面部畸形，矮小，不同程度的智力缺陷，行为问题和多种心脏缺陷。Noonan综合征（NS[MIM:PS]）是最常见的RAS病，有多种临床症状。其遗传异质性高，有十余个基因的致病变异可以致病。大多数病例由PTPN11，SOS1，RAF1，RIT1和LZTR1基因发生的突变导致。在这项研究中，作者证明了MAPK1的新发错义变异可以导致RAS病谱系中的神经发育异常。作者收集了7个没有血缘关系的病人的临床资料，利用原代成纤维细胞和细胞系异位表达病人的突变来证明这些突变促进了刺激依赖的激酶功能增强（gain-of-function,GoF），并利用线虫（C.elegans）测试体内实验中氨基酸替换对活性的影响。计算机预测和体外实验显示变异通过不同程度的影响激酶与调节因子和底物的相互作用对MAPK1的功能产生影响，并且此GoF仍旧依赖MEK活性。结果1.MAPK1新发错义变异导致RAS病谱系中的神经发育异常在7例病人中发现的新发错义变异见上表。这7例病人有同样的神经发育异常，在一部分病例中提示RAS病。尽管病人间的表型不尽相同，但是他们都有发育落后（developmentaldelay,DD），智力障碍（intellectualdisability,ID）和行为问题（例如ADHD，焦虑等）。大约半数病人有生后生长落后。颅面畸形也很常见，包括眼距宽（5/7），上睑下垂（6/7），下睑裂（3/7），低位/后旋耳（6/7），宽鼻梁（3/7）和牙齿异常（4/7），这些同样是RAS病病人的常见特征。除了颅面畸形病人同时还存在短/蹼颈，后发际线低，皮肤症状和生长缓慢，证实了临床怀疑的Noonan综合征。4名患者有先天性心脏病，包括房间隔缺损和二尖瓣关闭不全，但是没有患者有心肌病。两名患者有低肌张力和EEG异常，提示存在癫痫发作的风险，但是药物控制良好。没有病人诊断出肿瘤。2.MAPK1的错义变异是GoF变异MAPK磷酸酶（MKPs）催化的Thr和Tyr去磷酸化是MAPK失活的必要步骤。这两个残基的可逆性磷酸化和激酶的胞内分布位置控制激酶活性的强度和时间，决定细胞对刺激的反应。因为MAPK1变异的患者临床症状和Noonan综合征有重叠，且后者是由MAPK信号通路上调导致的，作者假设这些病人的MAPK1变异也是GoF的。为了证实这个假设，本文验证了这些和疾病相关的氨基酸替换对MAPK激酶的磷酸化状态和胞内分布的影响。在表达MAPK1变异p.Ile74Asn,p.His80Tyr,p.AlaVal,p.AspGly,p.AspAsn和p.ProArg的细胞系中进行EGF刺激的时程实验，表达变异蛋白的细胞系pMAPK1/3水平比野生型显著增加（图1）。图1MAPK1蛋白位于细胞质的基底部，在受到刺激时转移到细胞核。Thr和Tyr残基磷酸化促进MAPK1向细胞核转移。在应激情况下，变异细胞的MAPK1核内转移要强于WT（图2）。图2RSK1-3和MCL1是两种细胞质中的激酶底物，免疫印记显示突变导致的MAPK1磷酸化增加使RSKs和MCL1的磷酸化也上调了（图3A）。MAPK1可以催化ERK磷酸化，使后者与对血清反应的启动子结合，启动目标基因的转录。ELK1反式激活试验显示大多数表达突变蛋白的细胞均有对刺激反应增强，而在未刺激状态下则没有差异。另外，p.AlaVal突变细胞只有轻度增加，而p.Ile74Asn突变细胞和WT相仿，提示不同活性区段的变异对激酶功能的影响不同（图3B）。图33.MAPK1变异的体内实验线虫的mpk-1/sur-1基因是MAPK1的同源基因，有81%的相似度。MPK-1参与多种LET-60（RAS）介导的发育过程，包括外阴细胞的命运。LET-60信号通路上调可以导致多阴畸形(multivulva,Muvphenotype)，反之，下调则可以导致无阴表型(vulvaless,Vulphenotype)。作者使用CRISPR-Cas9技术制作了mpk-1线虫模型，其中mpk-1(pan14[DG])类比于病人携带的c.AG(p.AspGly)变异（图4A）。由此产生的线虫没有表现出任何Vul表型，排除了突变的LoF/显性负作用。与之相反，突变的线虫出现了低频率的Muv表型，并且部分拯救了携带let-23亚等位基因动物的Vul表型（图4B-D），提示LET-60和MAPK级联反应上调。与之一致的，在线虫中同样观察到了外阴前体细胞过度诱导（图4E）。图44.MAPK1变异GoF的机制主要是MKP3负调控缺陷MAPK1只有一个激酶结构域（残基25-），由两个叶组成。图5A显示了MAPK1复合体和MKP3的D-结构域的一个肽链的结构。黄色代表活性区域，红色代表磷酸化残基Thr和Tyr，浅蓝色代表α螺旋，兰紫色半透明表面代表突变的残基，绿色半透明表面代表MKP3的D-结构域。激酶与底物、支架蛋白、正调控因子（MEK1/2）和负调控因子（多种MKPs）的相互作用由另外两个关键区域负责，分别是D-siterecruitmentsite(DRS)和F-siterecruitmentsite(FRS)。图5突变影响的残基均分布在两个特别的区域：His80,Asp,Glu和Pro接近DRS，而Ala位于活性区域，Ile74与之相互作用（图5A）。MAPK1由DRS与正调控因子（i.e.MEK1/2），负调控因子（i.e.MKP3和PTPN7）和其它底物（i.e.MNK1）图5B）结合。MKP3、PTPN7和MNK1与Asp形成盐桥相互作用，并与该区域的其他受影响残基(His80,Glu和Pro)相互作用。但是在与MEK2相互作用的情况下，结合就非常松散。因此，预测影响该区域残基的错义变异会影响DRS对信号伴侣的亲和力，而在与MEK2结合的情况下影响较小。这与已经发表的结果一致：在非洲爪蟾实验中，p.AspAsn（相当于人类的p.AspAsn）导致与MKP和MNK1的结合下降，但只部分影响了与MEK2的结合。另外，小鼠的p.AspAsn（等同与人类p.AspAsn）导致MKP3的结合度和对ELK1磷酸化的催化效率下降了10倍。而肿瘤相关的p.GluLys和p.GluVal则表现出对MKP3介导的去磷酸化抵抗。Ala位于活性区段，这个区域在Thr和Tyr磷酸化激活MAPK1活性的时候会改变构向（图5A）。此外，该残基通过与Leu的疏水相互作用与催化位点相连（尤其是与保守的HRD结构域）（图5C）。替换为Val会干扰活性区段的变构。最后，Ile74所在的C螺旋在MAPK1的激活中起着中心作用，它包含保守的Glu71，其与磷酸基结合残基Lys54形成盐桥以稳定位置（图5C）。为了用实验验证致病性MAPK1氨基酸替换对激酶结合特性的不同影响，作者使用免疫共沉淀评估突变蛋白与MEK1和MKP3的结合。结果显示所有的突变蛋白MEK1免疫共沉淀量均和WT相仿，提示突变并不影响与激酶的正常结合。相反的是，所有的突变蛋白在EGF刺激下与MKP3的共沉淀量均有减少，提示对磷酸酶的结合有不同程度的下降，并且DRS区变异的蛋白下降程度最高（图6A）。所有的结果加起来证明了MAPK1变异致病至少有一部分是激酶与信号伴侣结合受到不同程度干扰的结果。5.MAPK1变异促进的信号上调仍旧依赖于MEK活性收集到的生化数据提示MAPK1变异的激活是刺激依赖的，因此作者推测突变驱动的异常增强信号可能通过抑制MEK的药物控制。图6作者对过表达MAPK1变异的HEK细胞和p.AspGly杂合原代成纤维细胞使用了曲美替尼，一种MEK1抑制剂，然后检测MAPK1、RSK和MCL1的磷酸化水平。结果显示EGF刺激的转染细胞和成纤维细胞中MAPK1、RSK和MCL1的磷酸化水平在使用曲美替尼治疗后均明显下降了（图6B），提示MAPK1突变直接依赖于MEK1，通过MAPK级联反应驱动信号通路上调。讨论此研究证明了生殖系MAPK1错义变异可以导致RAS病谱系中的神经发育异常，在一些受试者中有类似于Noonan综合征的表型。研究中发现的等位基因系列非随机分布，且insilico,invitro和invivo结果一致提示MAPK1的致病变异导致GoF，使MAPK级联反应上调。研究结果结合起来提示导致发病的氨基酸改变可以分为至少两个亚组，为影响DRS的变异导致功能激活提供机制解释。原文：Mottaetal.,EnhancedMAPK1FunctionCausesaNeurodevelopmentalDisorderwithintheRASopathyClinicalSpectrum,TheAmericanJournalofHumanGenetics(),