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1.2脑缺血预处理可抑制钙超载
脑缺血时，出现能量代谢障碍，导致细胞ATP供应不足，pH值降低使依赖于ATP的Na+，K+-ATP酶失去活性，进而使细胞内Na+，Ca2+增加，K+降低。正常状态下，酸敏感离子通道（acid-sensingionchannels，ASIC）通道可通过输运氢离子来调节细胞内外pH稳态，缺血再灌注后，血脑屏障的破坏，炎症反应，胞内pH值降低使ASIC对Ca2+开放，形成Ca2+通透的同聚体通道，细胞膜通透性增高，诱发细胞和组织代谢功能障碍。NMDA受体是Ca2+配体通道，可被Mg2+电压依赖性阻断。脑缺血时，线粒体损伤，激活此受体，电压门控Ca2+通道开放，胞内Ca2+浓度的升高使依赖Ca2+的相关酶（如蛋白酶、钙依赖磷脂酶）激活，导致脑细胞的防御系统遭受到严重破坏。缺血再灌注时Na+/Ca2+的异常交换是引起钙超载的关键途径。胞内钙超载不仅会使具有活性的钙调蛋白增加，使5-HT和弹性蛋白酶释放增多，导致血管痉挛收缩，加重脑组织缺氧，而且会导致细胞结构及功能的破坏，最终导致细胞凋亡及坏死。
在预处理中，NMDA受体被激活，引起细胞质内的Ca2+适度增加，并非钙超载，此现象可抵御后期严重脑组织缺血导致的神经元死亡［6］。此外，NGP1-01可对电压依赖性钙通道及配体门控性钙通道进行双重阻断，进而阻滞皮层神经细胞在去极化时引起的钙内流，同时阻滞NMDA引起的钙内流，从而避免发生细胞膜崩溃［7］。Dave［8］等人发现缺血预处理可延缓线粒体损伤，保护线粒体功能，提高细胞对脑损伤的耐受性。Costa［9］等研究认为，Ca2+通道阻断剂可抑制高电压激活的Ca2+通道，减少胞内Ca2+超载，目前临床上常见的Ca2+通道阻断剂如双氢吡啶的尼莫地平、双苯碱氨类的脑益嗪等，均在临床应用中起到了良好的效果。
1.3脑缺血预处理可减轻促炎损伤
脑缺血再灌注后，炎性细胞浸润及其大量炎性介质的产生，贯穿整个脑缺血损伤的始终，炎症瀑布反应可以加重脑损伤。炎症细胞释放出细胞毒素包括活性氧族和炎症因子等引起炎症反应，其过度表达可加重脑损伤。
小胶质细胞（microglia，MG）是中枢神经系统内最重要的免疫细胞，被称作脑内固有的免疫细胞，脑缺血初期，MG被迅速激活，分泌大量免疫因子，可激活免疫反应，吞噬损伤的组织、细胞碎片，但炎症持续存在，则转化为慢性炎症，过度激活的MG吞噬功能增强，释放大量的兴奋性氨基酸、自由基（如氧自由基）、基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteninases，MMPs）引起血脑屏障通透性改变，加重组织损伤。产生的自由基一方面可以导致自由基损伤，另一方面可与炎性细胞因子一起激活炎症反应，形成炎症反应的恶性循环。因此通过给予预处理高位阻断炎症通路的级联放大可能成为治疗缺血脑卒中的靶点之一［10］。Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）是最重要的模式识别受体家族之一，在感染性炎症中扮演着重要角色。核因子（nuclearfactor-kappaB，NF-κB）是一种广泛存在于真核细胞中的转录因子。TLR4激活可导致NF-κB移位，是介导炎症因子表达和炎症反应的关键调节位点，抑制其活性可以减轻脑损伤。再灌注后，白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNF-α）、NF-κB、IL-6、IL-10等炎性因子的过度表达，可以诱导活化的内皮细胞过度表达，炎症反应加剧，同时血脑屏障也受损。
缺血预处理可通过引起脑内细胞和细胞外基质的轻度损伤，释放少量内源性配体，轻度激活TLR4信号通路，导致少量炎性递质释放，诱发轻微炎症反应，同时上调抗炎因子、诱饵受体等的表达，抑制NF-κB炎性信号通路、激活TRIF通路使得促炎性因子生成减少、抗炎性因子生成增加，从而抵御后期严重脑缺血诱发的打击［11］。TLR4内源性配体高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox-1protein，HMGB1）在缺血性脑损伤过程中起到重要作用。近期研究表明HMGB1可作为促炎细胞因子参与炎症反应，是感染的晚期阶段被释放的炎症因子，可维持和延长炎症反应。炎症状态下，HMGB1主动分泌至胞外，与糖化终末产物受体（receptorforadvancedglycationend-products，RAGE）和TLRs结合，最终激活NF-κB，介导炎症反应。Hu［12］等人发现HMGB1预处理对心脏、肝脏等器官的再灌注损伤后起到了保护作用。
缺血预处理通过PI3-K/Akt和ERK1/2信号通路抑制炎症介质的表达和炎症反应，这可能是缺血预处理减轻缺血性脑损伤的机制之一。研究发现，缺血预处理后TNF-α浓度的轻微升高可形成对后续更严重缺血的耐受。故阻断或者抑制TLR4信号通路上各个节点的药物，理论上均可以应用于临床。已有实验证实细菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）由于能减弱TLR4炎性信号传导通路的表达，具有类似缺血预处理的神经保护作用［13］。
1.4缺血预处理可减少兴奋性递质，增加抑制性递质
EAA是中枢神经系统的兴奋性神经递质，在神经元缺血性损伤中起重要作用，尤其谷氨酸是中枢神经系统含量最高、分布最广、作用最强的兴奋性神经递质。脑组织的缺血缺氧会造成细胞能量代谢障碍，神经元释放大量谷氨酸等兴奋性氨基酸，细胞外过高浓度的兴奋性神经递质（谷氨酸）具有神经毒性，可激活NMDA受体及兴奋性受体AMPA，其作为一种外界死亡信号与质膜上受体结合，并激活细胞内的多种蛋白酶、磷脂酶和还原型一氧化氮合酶等，引起兴奋性神经元持续去极化，钙内流增加，线粒体功能障碍，诱导细胞凋亡［14］。星形胶质细胞的兴奋性氨基酸转运体1（excitatoryaminoacidtransporters，EAAT1）与EAAT2参与了脑内谷氨酸的转运，缺血预处理可以使星形胶质细胞中谷氨酸转运体1（glutamatetransporter-1，GLT-1）表达上调［15］，从而导致胞间谷氨酸的水平降低，抑制性氨基酸-γ-氨基丁酸释放增多，谷氨酸脱竣酶活性增加，并产生脑的缺血耐受性，从而起到保护作用［16］。同时，缺血预处理还通过TNF-α转换酶/TNF-a/TNFR1通路介导，引起EAAT2和EAAT3的表达增加［15-17］。缺血预处理后，NMDA的表达相对增多，但远未达到严重脑缺血NMDA的表达量，使得细胞膜对Ca2+通透性降低，且促进部分炎性细胞因子的表达，从而引起脑组织对缺血缺氧的生理性应激反应减轻组织损伤［17］。
1.5缺血预处理可调节自噬
自噬在缺血、缺氧等情况下可被适度激活，并促进组织细胞存活。已有离体细胞实验证实，短暂的非致死性氧糖剥夺可通过诱导自噬以减轻后续致死性氧糖剥夺导致的细胞损伤［18］。在细胞轻度缺血、缺氧和（或）有缺血、缺氧前预处理的情况下，自噬大多被适度激活，这种情况下能促进细胞存活，使细胞结构或自噬体抵御后续的致命性损伤［19］。而在致死性缺血、缺氧和预处理的时候，自噬大多被过度激活，导致大量胞质蛋白降解及重要细胞器的自我消化，参与细胞凋亡的级联反应，从而使功能丧失，甚至细胞裂解以致死亡，起到了损害作用，又称为Ⅱ型程序性死亡。然而，没有确切的证据表明在哪种情况下自噬可以发挥神经保护作用来抵抗脑缺血本身。已有研究表明，内质网通过三磷酸肌醇（inositoltriphosphate，IP3）受体和B细胞淋巴瘤-2（Bcelllymphoma-2，Bcl-2）与自噬现象相关联，并认为胞质Ca2+浓度升高可有效地诱导自噬发生［20-22］。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associatedprotein1lightchain3，MAP-LC3），简称LC3，也参与了自噬的形成，是哺乳动物细胞中常见的自噬小体标记蛋白之一，分为LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种，发生自噬的细胞中LC3-Ⅱ会有明显的增加，自噬激活剂雷帕霉素预处理可显著上调LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平，而且雷帕霉素也能缓解脑水肿、减少梗死体积，可见自噬在预处理对脑缺血保护作用中起到了关键性的作用［23］。缺血预处理后Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的表达均下调，表明自噬活性下调，产生了神经保护作用［24］。
1.6脑缺血预处理的其他保护作用机制
脑缺血预处理对脑缺血再灌注损伤保护作用除上述机制外，至少还涉及以下几种机制：①缺血预处理可以诱导修复基因的表达，促进神经再生和血管生成，例如可以促进许多生长因子的表达，包括脑源性神经营养因子、促红细胞生成素、神经胶质源性生长因子、血管内皮生长因子、血管生成素等；②缺血预处理可以抑制脑缺血损伤后细胞凋亡和坏死，进而起到保护神经元的作用，减轻随后发生的更为严重的致死性缺血性脑损伤；③预处理可维持线粒体ATP酶、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）和丙二醛（methanedicarboxylicaldehyde，MDA）水平来对抗线粒体损伤［25］；④NO在Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt、NF-κB、EGFR/ERK/p38MAPK等信号通路中起到关键作用［26］。缺血预处理可以降低脑组织NO的水平，从而发挥脑保护的作用。总之，缺血预处理的保护作用是通过多种机制相互作用、相互配合来共同参与的。
2缺血预处理对脑缺血再灌注损伤关键通路的调节2.1JAK-STAT通路
JAK/STAT信号通路参与中枢神经系统的发育、神经细胞的增殖与分化，通过将胞膜的刺激信号传递到胞核，从而对机体应激、凋亡、炎症、免疫调节等重要的病理生理过程进行调控，是细胞内细胞因子信号传导的重要途径。脑缺血以及再灌注损伤时，大量细胞因子（如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、CNTF、TNF-α）和生长因子（如EGF、PDGF、EPO）等被释放，这些因子激活JAK/STAT信号通路［27-28］。JAK/STAT信号通路激活后的JAK与特定的JAK结合位点结合发生酪氨酸磷酸化而活化，使其成为STAT和其它细胞内信号分子的结合位点，集聚到该位点上的STAT在JAK的作用下被磷酸化激活，磷酸化的STAT作为一种转录因子，形成同源或异源二聚体转移到细胞核内，进而启动并促进相应目的基因转录［29］。JAK/STAT信号通路的激活加重缺血再灌注损伤，与氧化应激关系密切。已有研究表明，缺血时STAT家族成员STAT1具有促进细胞凋亡的作用，STAT3活化则增加细胞存活。多项研究表明STAT1基因敲除的小鼠可减少再灌注损伤，这可能是因为减少了半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活化及神经细胞的死亡。缺血预处理可通过JAK1、JAK2使STAT1和STAT3酪氨酸磷酸化，MAPK/ERK激酶通路使STAT1和STAT3丝氨酸磷酸化，从而上调诱导型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）水平，同时形成耐受，减轻脑组织损伤。Li等［33］人发现神经调节蛋白1β可以通过活化JAK/STAT信号转导通路，促进星形胶质细胞胶质化和调节神经细胞的抗凋亡机制发挥保护脑缺血损伤中的作用。GorinaR等［34-35］人发现JAK抑制剂AG能显著抑制JAK和STAT的活化，减少梗死体积，改善神经功能。JAK/STAT信号通路对血管生成也起到一定的调控作用，在心血管疾病的发生、发展过程中发挥了重要的作用［36-37］。
2.2Notch信号通路
Notch信号通路是一个在胚胎发育过程中高度保守的调节细胞功能的信号通路，通过介导细胞-细胞相互作用，精细调控着细胞的增殖、分化、及凋亡。Notch信号可抑制神经祖细胞的分化，决定细胞的命运。Notch信号通路主要是通过Notch/NICD/HES-1信号转导系统调节中枢神经系统的发育。大量的研究表明Notch信号通路在脑缺血再灌注损伤中扮演着重要的角色，Notch信号的活化可以增强细胞凋亡级联，可活化小胶质细胞并促进白细胞浸润，促进成熟神经元的突触可塑作用，从而在一定程度上促进缺血后神经干细胞的存活。Notc通过激活是血管发生和功能血管最终形成的重要调控因素，Lou等［38］人观察到脑缺血时Notch1蛋白的表达明显增加，进一步论证了其增强内皮细胞血管形成。Notch信号通路与缺血预处理激活的多项信号通路均存在调控关系，如MAPK通路、PI3K-Akt通路、NF-κB等，STAT3在某些条件下是Notch通路的下游效应器。Notch信号还可以调节MAPK相关途径，Zhang等［39］人发现p38MAPK在缺血预处理诱导的缺血耐受过程中GLT-1的上调过程起重要作用。p38在应激条件下被激活，进而促发了神经元的凋亡。因此，通过缺血预处理诱导p38适时、适度的表达，就有可能调动其保护机制、发挥保护作用。Notch信号通路可反映缺血性脑卒中的发病机制，在一定程度上调控JNK/c-Jun信号通路，可表现为Notch1胞内段（Notch1intracellulardomain，NICD）过表达促进JNK/c-Jun信号通路的激活，从而加重脑损伤［40］。缺血性脑卒中Notch信号通过NF-κB和HIF-1α途径诱导神经元死亡，Cheng等［41］人进一步论证了使用γ分泌酶抑制剂通过抑制Notch-JNK通路来治疗脑卒中。
2.3NF-κB信号通路
NF-κB是最初在成熟B淋巴细胞的核提取物中检测到的信号分子，之后发现NF-κB广泛存在于各种类型细胞，如单核巨噬细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及神经元等，是一种具有多向转录调节作用的特异性DNA结合蛋白。NF-κB是Rel蛋白家族中一种重要的核转录因子，由两种Rel家族亚基组成的同源或异源二聚体。在静息状态下，NF-κB与其抑制因子IκB结合存在于胞浆中，无转录活性，当受到应激、紫外线、感染、损伤等刺激时，IκB被磷酸化，与NF-κB分离，NF-κB被激活，迅速转移到胞核，诱导一系列特异基因的表达。已有大量研究表明，NF-κB调控多种细胞因子及炎症因子的表达，如黏附分子、炎症因子、趋化因子等。NF-κB与下游炎症因子之间存在正反馈关系，对炎性反应中炎症因子基因的转录发挥重要作用，因此通过抑制NF-κB信号通路，下调相关因子表达，可减轻脑缺血再灌注损伤。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrroledithiocarbomate，PDTC）为NF-κB的特异性抑制剂，其通过抑制NF-κBp65亚单位或IκB的降解来抑制NF-κB的激活［42-43］。NF-κB诱导凋亡相关基因的表达也是神经细胞凋亡与自噬的重要途径，Li等［44］人提出脑缺血通过NF-κB通路调节自噬性损伤，此通路可作为靶向治疗脑卒中。SIRT1属于Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，Hernandez-Jimenez等［45］人发现SIRT1通过对NF-κB诱导的炎症和凋亡通路的乙酰化和即刻抑制，从而起到神经保护的重要作用。李等［46］人发现缺血预处理后，ERK通路的激活可能通过诱导Fos、Hsp70表达，减少NF-κB的生成来发挥保护作用。
2.4缺血预处理对脑缺血再灌注损伤调节涉及的其他通路
缺血预处理对脑缺血再灌注损伤的调节作用除上述重要通路外，至少还涉及以下几条通路：①MAPK信号通路，MAPKs家族主要包括ERK1/2，JNK，p38和ERK5/BMK1。JNK和p38信号通路介导的细胞凋亡在调节炎症反应中发挥重要作用。JNK信号通路的抑制参与了脑缺血耐受的形成，CIP诱导脑缺血耐受过程中p38MAPK的活化和GLT-1蛋白的表达上调［39］；②PI3-K/Akt信号通路是重要的细胞存活信号通路，PI3-K/Akt活化后可减少Bad介导的细胞凋亡［47］。近年来，多项研究结果认为，缺血预处理通过PI3-K/Akt信号通路减轻缺血性脑损伤诱导的细胞凋亡。缺血预处理之前脑室内注射Akt抑制剂LY可抑制缺血预处理减轻缺血性神经功能损伤的作用，说明PI3-K/Akt信号介导了缺血预处理对缺血性脑损伤的神经保护作用［48］；③Numb信号通路促进脑缺血诱导的细胞凋亡，Ma等［49］人通过体外氧糖剥夺实验证实Numb的激活表达与凋亡激活呈正相关，Zhou等［50］人通过动物实验发现Numb与TRAF6相互作用可导致TRAF6的降解，进而抑制NF-κB信号通路；④TLRs信号通路：TLRs是一种模式相关受体，TLR4信号的激活在脑缺血诱导的脑组织损伤及神经元死亡中起至关重要的作用［51］。TLR4受体激活后导致NF-κB易位，激活下游炎症因子的表达上调，抑制其活性则可以减轻脑损伤［52］。Wang等［53］人发现预处理下调TLRs炎症信号，从而降低缺血性脑损伤引起的炎症反应。Pradillo等［54］人通过对TLR4敲除小鼠以及正常小鼠进行缺血预处理发现TLR4起重要的内源性神经保护作用。综上所述，参与脑缺血再灌注损伤的通路间存在交互作用，互相影响和级联。
3展望近年来，对于缺血预处理对脑缺血再灌注损伤保护作用已有一定程度的认识，但由于其相关机制及通路之间关系复杂，仍然需要更深层次的实验性研究及论证。目前的研究大多限于动物实验，应用于临床仍存在局限性，但可喜的是，多项研究表明远隔肢体缺血预处理通过给予远隔肢体重复的缺血缺氧可增强脑组织对缺血缺氧的耐受能力，Li等［55］人已通过临床上单侧大脑中动脉狭窄的患者与健康志愿者进行试验性研究，并且论证了远隔肢体预处理的安全性及可行性。Liu等［56］人发现远隔肢体缺血预处理可以在严重脑缺血来临前通过动员外周免疫系统来提供保护作用，从而增强宿主的防御作用，体现了机体的调节作用。需要注意的是，远隔肢体缺血预处理存在的潜在风险还需进一步探究。如何靶向干预信号通路间的关键调控因子，防治再灌注损伤新药的研发是关键中的关键，具有十分重要的临床意义。随着这些深入的研究，找到更新的、安全的、有效的方法及药物将为缺血性脑血管病的防治带来美好的希望。
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