10步填上免疫组织化学IHC的坑

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免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)或免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位定性、定位或定量研究的实验技术。

总体来说IHC的实验流程和方法并不难，但做出漂亮的染色结果却不那么容易，在IHC实验中许多细节也也值得注意。那么细节主要是哪一些呢？且听我一一道来。

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标本固定

固定（Fixation）是使用化学试剂处理组织或细胞，的目的除了使细胞内的蛋白质凝固，减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更是为了保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。较好的固定剂具有渗透性强；其次不能使组织发生过度收缩变形；还需使组织得到一定的硬度，有较好的折光度。

固定剂多种多样，例如无水酒精对糖原保存较好，容易使细胞收缩，其性能与95%酒精相似，很少单独使用，一般只用于糖原的固定不同的抗原对固定液耐受程度不同。丙酮为易挥发的无色液体，有刺激性气体。可使蛋白质沉淀，渗透性强，细胞收缩严重，对核的固定差广泛用于酶组织化学中的各种酶的固定，也有人用于抗原的保存，作为细胞涂片免疫组化的固定液。

此外，有些固定剂对特殊组织有更好效果，如苦味酸对于头皮、指甲固定有软化效果，戊二醛（含有两个醛基，具有很强的交联作用）常用于电镜标本的固定，使用浓度为2.5%，PLP固定液（Periodate-lysine-paraformaldehyde，由过碘酸、赖氨酸和多聚甲醛混合组成的磷酸盐缓冲液）对于含糖组织抗原保存更好。如上所述我们需要根据实际情况选择合适的固定剂。

目前常用的固定剂有中性甲醛液（甲醛饱和水溶液称为福尔马林），4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。多聚甲醛固定效果温和，广泛应用于免疫组织化学研究。甲醛能够以固体的形式存在，即白色粉末状的多聚甲醛。将多聚甲醛溶于PB，加热至60℃（加热可使多聚甲醛解聚为单体，必要时可滴加少量NaOH促进其溶解），加热搅拌至液体透明为止。

固定方法多种多样，常用的有浸透法、灌注法、原位法、滴片法、蒸汽法、微波法等，其中以浸透固定和灌注固定效果最好。灌注固定中将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键，也是难点。首先准确找到主动脉，这是此步骤的要点。可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净，用眼科镊子轻轻夹住心外膜（夹的越少越好，以免影响取材）将心脏向左上方提起，即可看清主动脉，又可使灌注针很容易地插入主动脉内。

插入时动作要慢，针尖方向不要偏向右侧，以免刺入右心房，如果感到有阻力，则将针退后、调整方向重新进针，直到进入主动脉，灌注针进入主动脉后可在心脏的上方看到其位置，灌注针进入主动脉的长度最好为3-5毫米。网上有很多方法学网址在此推荐给大家：

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