俞卫锋教授缺血性脑卒中的调节性T细胞调

缺血性脑卒中治疗可行之路：神经炎症调控

缺血性脑卒中是由于脑供血动脉（颈动脉和椎动脉）狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的总称。其恢复是一个长期且复杂的过程，而且目前治疗手段有限。按照缺血类型划分，缺血性脑卒中可分为短暂性脑缺血发作（TIA）、可逆性神经功能障碍（RIND）、进展性卒中（SIE）以及完全性卒中（CS）。一项于年发表在《柳叶刀》杂志（Lancet）的全球疾病负担研究结果表明，缺血性脑卒中常年高居人类死因的前三位。

上海交通大医院麻醉科李佩盈医生于年发表在《神经生物学进展》杂志（ProgressinNeurobiology，IF=13.）的综述表明，在基础研究中，很多药物被证实具有神经功能保护作用，但是只有组织纤溶酶原激活物（tPA）能够成功地应用于临床治疗之中，而且tPA治疗存在两方面缺陷，一方面，tPA的治疗时间窗极短，为脑卒中发生后4~5个小时之内，故仅10%左右的患者得以有效治疗；另一方面，缺血性脑卒中能够激活大量外周免疫细胞，造成更为严重和长时间的神经继发损伤，而tPA难以治疗由于炎症反应引起的脑损伤。因此，对缺血性脑卒中引发的神经炎症进行调控为脑卒中的治疗提供了时间与空间的可能。

为了对神经炎症进行调控，改善缺血性脑卒中患者的预后，课题组找到了降低炎症反应的调控因子调节性T细胞（Treg）、探讨了Treg与中性粒细胞相互作用抑制脑损伤的机制、阐明了肿瘤并存状态下Treg再分布的原因、并对Treg的应用进行了展望。

Step1：Treg对缺血性脑卒中具有保护作用

研究背景

Treg是具有调节功能的成熟T细胞亚群，主要由胸腺中T细胞发育而来，最初在自身免疫性疾病及肿瘤治疗的免疫学研究中被发现，其调节功能在机体免疫稳态维持、移植耐受、肿瘤免疫、过敏反应及微生物感染等方面均得到了证实。一项于年发表在《自然医学》杂志（NatureMedicine）的研究表明，Treg是一种对缺血性脑损伤具有保护作用的内源性免疫细胞，能够通过抑制免疫过度放大对神经炎症反应进行调控。李佩盈医生于年发表在《神经病学年鉴》杂志（AnnalsofNeurology，IF=11.91）的研究表明，Treg对缺血性脑卒中具有保护作用。

Treg对短暂性局部脑缺血后引发的脑损伤具有改善作用

为了证实Treg对缺血性脑卒中具有直接的调控作用，并进一步评估其治疗价值，课题组建立大脑动脉闭塞（MCAO）小鼠模型，研究者采用免疫磁珠分选的方法，经过抗原CD4阴性以及CD25阳性细胞选择后（图1），从受试小鼠中提取出纯度为82%的Treg细胞，并经尾静脉注射至建立脑卒中模型的受试小鼠体内，提纯的Treg细胞对效应T（Teff）细胞增殖具有免疫抑制作用并表现剂量依赖性。结果表明，建立MCAO小鼠模型后2小时、6小时和24小时进行Treg细胞治疗均能显著改善脑卒中模型小鼠的脑缺血体积，其中2小时组的改善作用最为明显，因此研究者后续采用建立MCAO小鼠模型后2小时进行研究。

图1MCAO小鼠模型和流式分选方法的建立（引自PeiyingLiMD,YuG,Bao-LiangSunMD,etal.AdoptiveregulatoryT-celltherapyprotectsagainstcerebralischemia[J].AnnalsofNeurology,,74(3):–.）

Treg对脑缺血后功能的长期恢复具有改善作用

研究者在建立MCAO小鼠模型后2小时，静脉注射Treg细胞，对小鼠7天及28天后的脑缺血体积和感觉运动功能进行评估。微管相关蛋白-2（MAP-2）免疫染色结果表明，与脾细胞治疗组相比，Treg治疗能够减少脑缺血体积、延长脑缺血后神经保护时间、改善脑卒中小鼠远期的神经功能。

Treg对大脑炎症反应具有改善作用

为了探究Treg对脑缺血后炎症反应的影响，课题组于建立MCAO小鼠模型后24小时测定多项炎症标志物，与脾细胞处理组相比，白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-17（IL-17）以及肿瘤坏死因子（TNF-α）的mRNA表达维持在较低水平，两种主要抗炎介质白介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）显著上调。此外，脑损伤局部除小胶质细胞外，中性粒细胞、CD3阳性细胞和巨噬细胞浸润增加是损伤大脑炎症因子的主要来源，在建立MCAO小鼠模型1~3天后，脾细胞处理组中性粒细胞、T淋巴细胞以及巨噬细胞均有显著的浸润作用，而Treg组浸润作用显著减弱，虽然早期Treg在脾脏、淋巴结及肝脏等中均有检出，但并未浸润到脑组织。

Treg对脑缺血后BBB完整性具有保护作用

血脑屏障（BBB）完整性破坏、进而导致脑内免疫细胞含量发生改变是缺血性脑卒中的重要病理学表现。为了进一步探究前期研究中Treg去向，Treg能否通过保护BBB、抑制外周免疫细胞对脑组织的浸润，研究者采用荧光示踪剂（AlexaFluor）对MCAO小鼠模型的BBB功能进行评估，并对相对荧光强度（RFU）、IgG浸润面积（IgGarea）和灰度值（Grayvalue）进行检测。研究结果表明（图2），与脾细胞处理组相比，Treg处理后小鼠大脑薄壁组织中的荧光水平显著降低、颅内内源性免疫球蛋白G（IgG）显著降低。因此，可证实，Treg对于保护脑缺血后BBB完整性发挥重要作用。

图2Treg对血脑屏障的保护作用（Sham：假手术组；Sp：脾细胞处理组；Treg：Treg处理组；CTX：皮质组；STR：纹状体组，引自PeiyingLiMD,YuG,Bao-LiangSunMD,etal.AdoptiveregulatoryT-celltherapyprotectsagainstcerebralischemia[J].AnnalsofNeurology,,74(3):–.）

Treg对BBB的保护机制

课题组最新的研究发现，趋化因子受体（CCR5）介导了Treg细胞向受损的BBB迁移，CCR5的活化上调了程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）的表达、增强对中性粒细胞中基质金属蛋白酶（MMP）-9的抑制功能。

Treg的保护机制具体表现在，①脑卒中改变了Treg表面CCR5以及脑组织内CCR5配体的表达；②CCR5介导了Treg向BBB趋化，对保护脑卒中后BBB起到了重要作用；③CCR5活化通过上调PD-L1增强了Treg抑制中性粒细胞分泌MMP-9的功能。

中性粒细胞来源的MMP-9是Treg神经保护的主要靶点

多项于年到年期间发表在《神经科学杂志》（JournalofNeuroscience）及《脑卒中》杂志（Stroke）的研究结果表明，在发生缺血性脑卒中和BBB损伤后，啮齿类动物脑内和血浆中MMP-9水平显著升高。为了探究Treg治疗对BBB保护作用的原因、Treg是否抑制MCAO小鼠模型MMP-9水平的升高，研究者通过明胶酶谱对MCAO小鼠模型血浆和大脑中的MMP-9含量进行检测，检测结果表明，与脾细胞处理组相比，Treg治疗组血浆和大脑中的前体MMP-9和活化MMP-9在缺血后24小时均有显著降低；酶联免疫吸附试验（ELISA）及免疫荧光实验进一步证实，血浆中的Treg对MMP-9具有抑制作用；此外，研究者采用MMP-9基因敲除（MMP-9-/-）小鼠对以上结果进行验证、并通过骨髓嵌合体小鼠证明外周MMP-9是Treg细胞作用的靶点。

为了进一步证明Treg直接作用于中性粒细胞来源的MMP-9，研究者对中性粒细胞进行TNF-α预处理、并与CD3和CD28抗体致敏的Treg共培养。研究结果表明，Treg能够显著抑制中性粒细胞中MMP-9水平，但对中性白细胞弹性蛋白酶无抑制作用。研究者据此推测，Treg与中性粒细胞可能存在细胞与细胞的直接作用，但其作用机制需要通过进一步的实验证实。

Step2：Treg与中性粒细胞的作用机制

研究背景

程序性细胞死亡受体-1（PD-1）是免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，相对分子量55kD左右，早在上世纪90年代便已证明该分子与细胞死亡密切相关。PD-L1由细胞外区、疏水性跨膜区、细胞质区组成，广泛表达在T细胞、B细胞、单核细胞巨噬细胞及一些非淋巴组织中。当细胞表面的PD-1和PD-L1偶联后，PD-1/PD-L1可以传递免疫抑制性信号，发挥负性免疫调控作用。一项于年发表在《血液学》杂志（Blood）的研究结果表明，PD-L1在Treg抑制效应T细胞的增殖中发挥关键作用，PD-L1可能介导了Treg与中性粒细胞之间的相互作用。李佩盈医生于年发表在《Stroke》（IF=6.）的研究分别对Treg细胞和中性粒细胞进行纯化，提纯后的Treg细胞和中性粒细胞表面分别有PD-L1和PD-1表达（图3），在此基础上对Treg抑制中性粒细胞的分子机制进行探讨。

图3免疫细胞染色下PD-L1和PD-1在Treg细胞和中性粒细胞表面的表达情况（引自LiP,MaoL,LiuX,etal.Essentialroleofprogramdeath1-ligand1inregulatoryT-cell-affordedprotectionagainstblood-brainbarrierdamageafterstroke.[J].Stroke,,45(3):-64.）

PD-L1介导Treg抑制中性粒细胞分泌MMP-9

前期的体外实验表明，Treg表面的PD-L1、细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）以及TGF-β等可能是调控中性粒细胞的必要条件，为了探究这些分子对Treg与中性粒细胞相互作用的影响，研究者对分子抗体进行中和，并与中性粒细胞共孵育。研究结果表明，在中和PD-L1抗体后，Treg细胞对中性粒细胞MMP-9的抑制作用消失，但中和其他分子抗体抑制作用无明显改变。此外，研究者采用PD-L1基因敲除（PD-L1-/-）小鼠对以上结果进行验证，与对照组相比，Treg无法抑制PD-L1缺陷组MCAO小鼠模型MMP-9水平的升高、以及对分泌MMP-9的中性粒细胞脑组织浸润的抑制作用消失。

PD-L1介导Treg对缺血后BBB的保护作用

前期研究已经证实，Treg在保护脑缺血后BBB的完整性中发挥重要作用，研究者在中和PD-L1抗体后，Treg对BBB完整性的保护作用消失、并发生内源性IgG向脑组织的浸润。因此，PD-L1对Treg保护缺血后BBB发挥关键作用。

PD-L1在Treg的神经保护作用中不可或缺

研究者对MCAO小鼠模型脑缺血体积和神经功能进行评估，研究结果表明，对PD-L1抗体中和后，Treg无法减低缺血性脑卒中脑缺血体积、对神经功能的保护作用消失。此外，研究者通过PD-L1-/-小鼠的转移实验对上述结果进行了验证。

因此，Treg细胞与中性粒细胞通过PD-L1信号分子相互作用，PD-L1对Treg细胞保护缺血性脑卒中及BBB发挥重要作用，以上成果为后续研究打下了坚实的基础。

Step3：NRP-1介导Treg细胞再分布加剧肿瘤并存状态下缺血性脑损伤

研究背景

神经纤毛蛋白-1（NRP-1）是最早被发现的NRP家族成员，为细胞表面相对分子质量kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，位于形成中的神经纤维轴突上。一项于年发表在《自然免疫学》杂志（NatureImmunology）的研究结果表明，NRP-1是一种可介导免疫细胞间相互作用，作为启动初次免疫应答的基本物质。近年来，有研究表明，NRP-1除了可作为轴突导向因子-3A（Sema3A）受体外，还可表达与内皮细胞和肿瘤细胞表面，作为血管内皮生长因子家族（VEGF）的受体，在血管的生成、发育、肿瘤细胞的增殖和转移中起到重要作用。年与年发表在《临床肿瘤学杂志》（JournalofClinicalOncology）的研究表明，肿瘤并发脑卒中在临床中较为常见，肿瘤与脑卒中之间可能存在相互影响，但其相互影响的机制尚不明确。结合组内最新研究成果，俞卫锋教授课题组将在年国际脑卒中大会中对肿瘤与脑卒中相互影响的机制进行报告。

肿瘤并存状态加剧缺血性脑卒中的损伤作用

为了研究肿瘤并存状态对脑卒中的影响，研究者对小鼠皮下注射小鼠结肠癌细胞（MC38）及恶性黑色素瘤细胞（B16），并在21天后建立MCAO小鼠模型对脑缺血体积、神经功能及炎症反应进行检测。研究结果表明，肿瘤并存状态下脑缺血体积显著增加；自主攀爬运动小鼠模型结果表明，肿瘤并存状态加重了脑卒中后的神经功能损伤；此外，肿瘤并存状态下参与炎症反应的细胞对中枢神经的浸润作用显著增强，肿瘤并存状态加重了脑卒中后的神经炎症反应。

Treg的再分布对肿瘤并存脑卒中的影响

为了研究肿瘤并存状态下神经炎症反应增强的原因，俞卫锋教授课题组提出假设，Treg的再分布造成脑内Treg的含量减少，大量Treg细胞被募集到肿瘤组织，造成脑卒中因缺乏Treg保护而加重，肿瘤因Treg的免疫抑制而加速增长。研究结果表明，与对照组相比，肿瘤并存状态导致脑卒中小鼠外周及脑组织中Treg减少，如外源性补充Treg可逆转肿瘤合并状态加重缺血性脑卒中的现象。

NRP-1对Treg再分布发挥关键作用

肿瘤的生长与VEGF及NRP-1密切相关，相关实验已证实，NRP-1在肿瘤以及脑组织内的Treg上具有高表达。为了进一步探究引起Treg再分布的原因，研究者对NRP-1抗体中和后发现，小鼠外周Treg显著增加，肿瘤内Treg显著减少，抗体中和NRP-1可逆转肿瘤对Treg的募集效应。

Step4：后续研究展望

tPA是美国食品药物监督管理局（FDA）批准、唯一有效治疗缺血性脑卒中的药物，然而除了治疗时间窗极短外，脑出血也是tPA治疗需要面临的重要问题，病理学相关研究证实，脑出血的发生与血脑屏障的损伤密切相关。前期研究表明，Treg治疗可有效保护脑卒中后BBB，俞卫锋教授课题组提出Treg治疗可以减轻缺血性脑卒中tPA溶栓相关的脑出血，Treg与tPA联合治疗可能是未来的研究方向。

初步的研究结果表明，①tPA与Treg合用能够降低MCAO小鼠模型脑组织中血红蛋白的含量，表明Treg能够有效保护BBB；②与单独使用tPA相比，Treg能够减轻脑卒中后tPA溶栓的BBB损伤；③Treg能够减少tPA溶栓脑卒中小鼠模型的MMP-9；④内皮细胞趋化因子配体-2（CCL-2）对tPA引起的内皮细胞渗透性增加具有关键调控作用，Treg能够抑制CCL-2的分泌。该项研究成果已投稿至《脑科学》（Brain，IF=10.）杂志，并获得年脑科学大会青年研究者旅行基金。

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